1986年，Orthoclone OKT3^®的获批标志着单克隆抗体 (monoclonal antibody, mAb) 首次应用于临床。自 Orthoclone OKT3^®获批以来的30多年里，70多种抗体被批准用于治疗或诊断，占整个生物治疗市场份额50%以上。这类治疗药物之所以取得成功，得益于相较小分子化合物的关键优势，如较高的靶向特异性和极低的基因毒性。然而，抗体的临床前开发也面临着某些特有难题。抗体具有高度的物种特异性，不仅表现在与靶标结合的可变区，也表现在延长抗体半衰期所需的Fc区。

药物开发人员常利用细胞生成千上万种抗体，然后从中选择与靶标亲和力最强的抗体 (Singh et al., 2018)。根据相互作用的位点，抗体可阻断或激活目标蛋白，从而促进目标蛋白的清除，或者诱导针对表达目标蛋白细胞的免疫反应。此外，抗体还可以与药物或毒素偶联，增加特定部位的局部药物浓度。与其他在血清中半衰期仅有数小时的蛋白相比，抗体在血液循环中十分稳定。免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 是治疗开发过程中最常使用的抗体类型，其半衰期约为21天。 IgG半衰期较长是因为 IgG 与新生儿 Fc 受体 (Fc receptor, FcRn；又称Fc gamma receptor and transporter, FCGRT) 之间存在相互作用。

本文中，我们将讨论抗体类治疗药物研发中的一些难题，包括评估药代动力学特征、选择有疗效的候选抗体分子以及确定适合的给药剂量。

 

 

单克隆抗体，特别是IgG类抗体，其半衰期显著长于其他分子，同时具有较高的靶向特异性。这两项特征使IgG mAb 成为研发治疗药物的理想之选。

 

延长治疗性抗体的半衰期能够提高疗效、减少患者的治疗次数，从而降低患者的治疗和用药成本。在发现具有所需特异性的治疗性抗体后，研发人员通常会对潜在的候选抗体进行优化，提高Fc与FcRn的亲和力。由于缺乏可靠的实验工具来预测患者体内抗体的半衰期，这一过程往往困难重重。

 

使用小鼠模型预测候选治疗性抗体药代动力学(PK)数据的主要难点在于，不同物种对免疫球蛋白的处理方式不同。在哺乳动物中，大多数血液循环中的蛋白质会被内皮细胞和单核细胞持续摄取，并通过内体进入溶酶体进行降解。内体pH降低，从而为蛋白质进入溶酶体降解做准备。在该过程中，IgG蛋白会通过其Fc片段与跨膜受体FcRn相结合，从而避免降解。之后，FcRn-IgG复合物会重新定位于质膜，并将IgG释放回血清中。因此，相较于其他蛋白质以及其他抗体类型抗体(IgA 、 IgE 和 IgM)， IgG的半衰期显著延长。但是，人源IgG与人源或鼠源FcRn的相对亲和力差异极大，这使得野生型小鼠很难用作预测人类患者PK的模型。

 

抗体半衰期可能受到多种因素的影响，包括pH值、FcRn结合域或可变区的修饰、各种接头(linker)的使用以及有效荷载的类型(如抗体-药物偶联物)。因此，一组不同的治疗抗体需要进行PK表征，以便选出最理想的候选抗体分子。

 

人源IgG-FcRn相互作用的亲和力可以使用细胞结合试验或表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance）等经济有效的体外方法进行快速定量。最终需要获得半衰期、清除率 (clearance, CL) 和曲线下面积 (area-under-the-curve, AUC) 等临床相关PK值。通常情况下，体内PK测定方法为，通过静脉将候选抗体注射入动物模型中，随后几天内测定血清中的抗体浓度。最后，将清除率和半衰期值转换为患者体内的药代动力学估算值。

 

直到数年之前，现有动物模型在准确测定人源抗体的PK方面仍存在很大的局限性。例如，标准啮齿类动物模型相对廉价，且便于进行治疗性候选IgG的半衰期检测。但是，使用标准啮齿类动物模型存在缺点，即小鼠源和大鼠源FcRn在与人源IgG结合时，其亲和力与人源FcRn存在较大差异，这导致获得的半衰期数据并不准确 (Ober et al., 2001)。因此，当使用野生型小鼠时，半衰期结果可能具有高度变异性，并且无法获得临床相关数据。出于Fc-FcRn结合的物种相似性考虑，非人灵长类动物可以合理准确地预测人源抗体在患者体内的PK；但是由于伦理和成本方面的原因，在药物开发的早期阶段将其用于筛选并不可行。

 

改善临床相关性、降低对非人灵长类动物依赖性的潜在解决方案之一为——使用经过基因修饰的小鼠模型。为了解决因缺乏临床前模型而难以准确预测治疗药物半衰期的问题，杰克森实验室的科学家Derry Roopenian博士开发了一种特殊小鼠模型。该小鼠缺乏内源性小鼠FcRn基因，并携带人的FCGRT序列，因此仅表达人源FcRn蛋白 (Proetzel and Roopenian, 2014)。人源化FcRn小鼠模型B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/ DcrJ (014565)（又称“Tg32”），和B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(CAG-FCGRT)276Dcr/ DcrJ (004919)（又称“Tg276”）可用于预测 IgG抗体在人体内的PK，其准确性可媲美非人灵长类动物。此外，小鼠之间的变异性极小，因此每项研究所需的动物数量也较少。

 

就PK结果而言，已获得临床批准的治疗性抗体在人源化FcRn Tg32小鼠中的结果与临床患者观察到数据显著相关——这可能是因为Tg(FCGRT)32Dcr由人启动子和增强子调控表达。当对于多种人源IgG治疗药物的PK特征进行大规模比较时，这些药物在人类患者和非人灵长类动物以及Tg32小鼠中的半衰期和清除率范围非常接近。尽管各药物在Tg32小鼠中的半衰期较短，但从最短到最长的半衰期顺序与临床患者观察到的数据高度相关，因此能够通过异速放大法将Tg32小鼠中的药物清除率和半衰期转换为人类患者中的药代动力学数据。

 

 

 

值得注意的是，许多人源化FcRn转基因模型具有正常的小鼠免疫系统。因此，研究中的人源抗体有可能引发抗药抗体 (antidrug antibody, ADA) 反应。出现ADA后（通常为给药后5 - 10天），人源IgG的半衰期将丧失或严重缩短，致使PK数据难以解释。如果仅有少数小鼠出现ADA，则可能需要舍弃受影响动物的数据。

 

在某些情况下，实验组的大多数动物都出现ADA反应，这会影响PK评估。如果担心候选治疗药物可能导致ADA，或是需要彻底避免ADA发生，可以考虑选择免疫缺陷背景的人源化FcRn小鼠模型。杰克森实验室的科学家已将Prkdc^scid基因回交到Tg32小鼠中，使其具有免疫缺陷（018441；B6.Cg-Fcgrt_^tm1Dcr Prkdc^scid Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ）。由于产生成熟B细胞需要Prkdc基因， scid突变小鼠无法产生抗体，从而排除了产生ADA的可能性 (Myzithras et al., 2017)。值得注意的是，由于内皮细胞和单核细胞是FcRn 介导再循环的主要场所，而scid突变并不会影响上述细胞的数量和功能，因此在这些模型中，免疫缺陷并不会影响PK相关数据。

 

抗体的使用已经解决了有关药物毒性的诸多问题。抗体的固有特异性使脱靶效应的可能性显著降低，并且抗体也不可能转化为毒性代谢产物。抗体介导的毒性主要源自非治疗部位的抗原表达，以及免疫调节抗体介导的免疫系统过度活化 (Brennen et al., 2010)。对于这两种情况，候选治疗药物的适当剂量能够有助于预防和限制不良反应。然而，如果无法获得用于预测人体中抗体PK的准确的临床前数据，在设计临床研究时设定治疗剂量就十分困难。在许多情况下，需要在临床试验中进行剂量递增研究，但这样会降低治疗效果，或增加出现副作用的可能性。

 

可使用杰克森实验室人源化FcRn Tg32小鼠对抗体PK参数进行准确的临床前评估，该小鼠具有人源FCGRT生理性表达模式 (Latvala et al., 2017)。在已有治疗靶标的情况下，Tg32小鼠还可以用于评估药效学研究中的剂量谱，从而缩小疾病治疗模型中的最佳剂量。这些数据可用于支持治疗性抗体临床给药剂量的相关决策。利用通过Tg32小鼠获得的PK参数及预测性异速放大获得的人类PK参数 (Betts et al., 2018)，临床医生可以估算达到预期治疗效果所需要的最佳剂量范围，从而减少在临床试验期间使用具有潜在风险的剂量递增研究。

 

白蛋白是仅有的另一种能够在酸性pH条件下与FcRn上独特位点相结合的天然配体。与IgG类似，白蛋白可避免被溶酶体降解，其在人体内的半衰期为21天。因此，可以将短效治疗药物与白蛋白偶联，以延长治疗药物的半衰期并增加暴露量，同时降低给药频率。

 

使用人源化FcRn Tg32小鼠 (014565) 进行人白蛋白临床前PK建模的挑战依旧是物种间亲和力的差异。小鼠源IgG对人源FcRn没有明显的亲和力，但小鼠白蛋白对人源FcRn 的亲和力却远高于人白蛋白。由于小鼠白蛋白对FcRn的竞争结合作用过强，导致在Tg32小鼠中人白蛋白的半衰期缩短。为使Tg32小鼠模型能够用于人白蛋白PK分析，杰克森实验室对其进行优化，靶向小鼠白蛋白基因构建了B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr/MvwJ (025201) 小鼠，又称“Tg32 Alb KO”小鼠。Tg32 Alb KO 小鼠中，人白蛋白的半衰期为14 - 16天，这与人体中半衰期接近。此外，与利用Fc变体改善候选治疗性IgG的PK类似，白蛋白变体也可以用于改善FcRn亲和力和PK。为了避免白蛋白-药物偶联或白蛋白亲和力变体导致ADA，科学家将Prkdc^scid基因移至Tg32 Alb KO小鼠，构建出具有免疫缺陷的小鼠模型（031644；B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid/J），它可用于白蛋白PK分析。

 

 

NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt/SzJ (005557) 又称NSG小鼠。经CD34+细胞人源化以提供人源免疫应答，并将患者源性异种移植物 (Patient Derived Xenografts, PDX) 植入NSG小鼠，已成为开发用于治疗癌症的免疫治疗抗体所需的重要模型。NSG小鼠携带小鼠源FcRn，因此使用该小鼠模型评估人源IgG治疗药物时，虽能较好地反映疗效，但无法理想地反映人类PK。现已通过增加Tg32对NSG小鼠进行改善，使其FcRn“人源化”，即 NOD.Cg-Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt Tg(FCGRT)32Dcr/J (028615)，又称“NSG Tg32”。但是，由于NSG和NSG Tg32小鼠表达特有的高亲和力Fcγ受体（FcγRI 和 FcγRIV），人源IgG在这两种小鼠体内的半衰期仍较短。在与人源IgG的结合能力方面，Fcγ受体远超FcRn，它就像水槽一样将人源IgG从循环中清除 (Li et al., 2019)。作为改善方案，JAX也正在积极地对NSG Tg32小鼠进行基因工程改造，使其不表达Fcγ受体。

 

 

 

抗体药代动力学的早期临床前评估结果会影响治疗药物开发的多个方面。人源化FcRn转基因小鼠模型的引入，为研究人员在药物开发早期选择具有最佳PK的抗体提供了新工具。反之，通过将资源集中于最有潜力的候选治疗药物上，药物开发人员可以提高其产品开发成功率，并更快地将有效的抗体疗法推向临床应用。

 

杰克森实验室的hFcRn小鼠模型平台能够模拟人源IgG特定的生理学特征，并为药物开发早期阶段中评估候选治疗性抗体的PK提供了理想的模型平台。此外，这些模型为预测候选治疗性抗体和Fc变体在患者中的PK数据提供了一种可靠有效的方法，并且可以节省时间和成本。

 

杰克森实验室治疗性抗体评估服务可提供这种独特的hFcRn小鼠模型相关抗体评估服务研究人员也曾直接参与上述模型的开发和早期表征工作。杰克森实验室的服务产品凭借丰富的经验积累，能够从研究设计到实施给予全方位的优质指导，获得快速且经济有效的IgG治疗药物评估，帮助客户获得与医学转化相关的准确的药代动力学数据，从而确定最有可能应用于临床的治疗性分子。