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小鼠基础知识六：什么是 Cre-lox
作者：TIS 杰克森实验室
文章内容
Cre-lox系统是以小鼠作为研究工具，可对体内进行组织时空特异性的基因敲除、敲入及示踪。Cre-lox系统因其成 熟高效的特性，已被广泛应用于各项体内实验研究中。什么是Cre-lox？本文将从基本原理、应用场景和如何检索相关小鼠品系三方面为大家介绍。
1. Cre-lox基本原理
Cre (Cre recombinase 重组酶)：最初在P1噬菌体中被发现，特异性识别loxP位点，可以对两个loxP位点进行催化重组。
loxP位点 (图 1)：34个碱基对构成的回文序列，中间间隔的8个碱基对决定了loxP位点的方向。两个loxP位点的位置和方向决定了Cre重组的方式，包括敲除，反转和易位。
图1：LoxP 位点序列
2. Cre-loxP 应用场景
携带loxP的小鼠被称为floxed小鼠，当它与Cre小鼠交配后，Cre-loxP系统开始工作， 可以对两个loxP位点以内的基因进行重组，进而实现基因敲除、表达等目的。
• 组织特异性敲除 (Conditional Knockout, cKO)
如图 2 所示意，当组织特异性Cre小鼠与Floxed小鼠配繁后，两个loxP位点位于同一 条染色体上，且方向相同。Cre 重组酶可以介导特定组织中两个同向loxP位点发生同源重组。致使“Gene X"处序列被删除，如果该序列的删除使得该基因发生移码突变， 则达到基因敲除的效果。
图2：Cre-lox系统实现基因敲除的原理
例如：B6.FVB-Tg(Pdx1-cre)6Tuv/J (strain#: 014647)
该品系是由mouse Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1) 启动子驱动的Cre小鼠，与Floxed小鼠配繁，可以靶向胰腺组织进行特异性敲除。
具有组织靶向性的Cre小鼠品系很多，在文章后面会介绍如何检索。
• 组织特异性过表达 (Conditional Knockin, cKI)
Floxed小鼠转入某个基因的编码序列，并在这段编码序列前面插入“LoxP-STOP-LoxP, LSL” 元件 (图 3)。因此，该Floxed小鼠并不表达插入的基因；当存在Cre重组酶时， STOP元件被删除，插入基因才会表达。该体系可用于构建基因条件性敲入小鼠模型。
图3：Cre-lox系统实现条件性表达的原理
• Cre报告品系及谱系示踪
对于Floxed小鼠而言，如果LSL元件后续插入的基因编码为LacZ、GFP等基因。当存在细胞或组织特异性的Cre重组酶时，STOP元件被删除, 后续基因可以显色或表达 荧光基因，从而可以实现对某类细胞或特定组织示踪的目的。
• Cre-ER系统
Cre-ER是Cre重组酶与雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 激素结合域的融合蛋白。 未使用雌激素或雌激素类似物他莫昔芬 (Tamoxifen) 诱导时，Cre重组酶停留在细胞质中，无法对loxP位点进行重组。在经Tamoxifen诱导后，Cre重组酶进入细胞核中启动loxP位点重组。(图 4)
图4：Tamoxifen诱导Cre-lox系统启动重组功能的原理
因此，组织特异性Cre-ER和loxP的结合使用，可以实现对基因空间、时间的双重调控。Cre-ER的改进版本 — Cre-ERT2，在雌激素结合域携带G400V / M543A / L544A三位点突变，其在无诱导物情况下本底活性更低，而对Tamoxifen 的敏感性却更高。 关于诱导型 Cre 的相关问题，我们会在小鼠基础知识系列第八讲中为大家进行更加详细的介绍。
3. Cre-lox 数据资源库
JAX收录了1000多种Cre表达的小鼠以及更多的Floxed小鼠。其中很多小鼠都有较多的文献引用和验证数据。可以使用 JAX 小鼠搜索引擎快速查找相关品系。
• Floxed 品系查找
使用 JAX® Mice Database (JAX® 小鼠资源库)来进行搜索。您可以使用筛选框内Strain Attributes – Conditional ready (e.g. floxed) 条件 (图 5)。
图 5. 使用 JAX® Mice Database (JAX® 小鼠资源库) 检索 Floxed 小鼠品系
• Cre 品系查找
您同样可以使用 JAX® Mice Database (JAX® 小鼠资源库) 通过关键词来搜索cre表达的品系。搜索时，在左侧筛选框中选择 “Cre Expressing” 即可。
除此以外，在 JAX® 的常用Cre小鼠目录中提供了多种在不同组织中已经验证过特异表达的Cre小鼠，您可以在该网页中寻找您想要的特定组织Cre表达小鼠。
如果以上没有您需要的Cre小鼠，还可以通过MGI的 Cre Portal (www.creportal.org) 网页进行搜索， (图 6)。
图6: 使用MGI database检索Cre小鼠品系
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