利用小鼠模型进行传染病研究（一）
作者：阮菊新 博士  2020年4月14日
 

自中国政府于2019年12月31日首次向世界卫生组织报告发现新型冠状病毒肺炎（COVID-19）以来，截至2020年3月27日，短短3个月不到，造成此次新型冠状病毒肺炎的SARS-Cov-2病毒已经导致全球超过53万人确诊感染，累计24,000多人死亡，波及170多个国家和地区，且疫情传播范围还在持续扩大中。

 

此次疫情也使人们更加重视传染病的预防和治疗。其实，在全球范围内，传染病一直是导致人类死亡的重要因素之一。按照世界卫生组织2019年发布的统计数据显示，2016年，全球有430万人死于艾滋病（AIDS）、结核病（TB）、疟疾（malaria）、肝炎（hepatitis）和被忽视的热带疾病（neglected tropical disease, NTDs）等传染病，占全年统计总死亡人数的7.5%。2017年，全球新增HIV感染者180万人，新增结核病患者1000万人，有3.25亿人携带肝炎病毒。庞大的传染病感染人群不仅严重威胁人类健康，更给个人和政府公共卫生系统造成了沉重的经济负担。

 

了解传染病的感染途径、发病机制、病理特征及机体对传染病病原体的免疫应答机制对于疫苗开发和疾病治疗极为关键，而利用动物模型进行体内研究是无法避开的环节。在动物模型中，小鼠扮演了非常重要的角色，它们在我们了解人类疾病机理和药物开发中的地位至今无法被其他动物模型所逾越。

 

小鼠与人类的免疫系统比较

 

免疫系统在个体抵御病原体入侵和清除过程中担任着主要职能。个体的免疫应答可分为固有免疫和适应性免疫。固有免疫指免疫系统广泛而及时的非特异性防御，包括但不限于上皮屏障、吞噬细胞（主要是中性粒细胞和巨噬细胞）、自然杀伤细胞以及补体激活。适应性免疫主要由B淋巴细胞和T淋巴细胞介导，它比固有免疫更专一，效应期更长。然而固有免疫和适应性免疫的界限通常没有那么泾渭分明，在功能上也不互相排斥。比如，自然杀伤细胞可以作为固有免疫和适应性免疫的桥梁。

 

小鼠是大多数免疫学家首选的实验工具，小鼠模型在许多方面都能很好地反映人类生物学，对小鼠免疫应答的研究工作已为我们理解人类免疫系统的工作机制提供了重要的信息。由于人类和小鼠间存在诸多相似之处，人们似乎逐渐忽略了两者间的差异，因此可能会假设在小鼠中观察到的现象也一定会在人体中出现。然而，由于小鼠和人类这两个物种早在约7千万年前就开始独立分化，两者在体型和寿命上相差巨大，所处环境也截然不同。身处不同的生态环境需要应对的致病媒介挑战也千差万别，这就导致了有些在人体中出现的情况事实上不会发生在小鼠身上，或无法在小鼠中重现。人类与小鼠的这些差异可能会导致明明成功的小鼠临床前研究在进入临床试验后宣告失败。

 

Javier Mestas和Christopher C.W. Hughes曾在2004年对小鼠与人类的免疫系统差异进行了全面的综述。这些差异涵盖了免疫系统结构和固有免疫系统以及适应性免疫系统的方方面面。比如小鼠具有明显的支气管相关淋巴样组织，但健康人基本上不存在这种组织，这可能与小鼠生活在离地面较近导致可吸入性抗原负荷过高有关。另外，人类和小鼠在白细胞亚群、防御素、Toll受体、诱导型NO合酶、NK抑制受体家族Ly49和KIR、FcR、Ig亚群、B细胞（BLNK、Btk和λ5）和T细胞（ZAP70和常见的γ链）信号传导途径成分、Thy-1、γδT细胞、细胞因子和细胞因子受体、Th1 / Th2分化、共刺激分子的表达和功能、内皮细胞的抗原呈递功能以及趋化因子和趋化因子受体的表达也都存在一定的区别。

 

当我们选用小鼠进行人类免疫系统功能机制的研究时，预先了解小鼠与人类免疫系统的差异可以让我们更有效的对模型进行选择和优化，对后续实验数据的正确解读也具有重要意义，在此我强烈建议大家阅读上文中提到的Javier Mestas和Christopher C.W. Hughes所撰写的综述。

 

利用近交系小鼠进行人类传染病研究

 

近交系小鼠是目前应用最广泛的实验小鼠。利用近交系小鼠进行传染病研究的优势在于：

 

  1. 小鼠对许多人类传染病同样存在易感性；
  2. 不同近交系小鼠对于同一种人类传染病的易感性差异为人类探索机体感染和免疫应答的遗传机制提供了宝贵的资源；
  3. 小鼠的遗传信息较为明确，且有效数据资源还在不断产生和完善；
  4. 适合进行遗传操作；
  5. 存在功能性的免疫系统；
  6. 种群容易获取，成本低，参数较易测量；
  7. 近交系小鼠模型中群内遗传差异最小化，研究的可重复性高。

然而在进行传染病研究前，我们还需要知道，不同的近交系小鼠间也存在免疫多样性。

 

Sellers等人在2012年发表在Vet Pathol上的一篇综述比较了几个常用近交系实验小鼠的免疫差异。他们从固有免疫和适应性免疫两个方面详细阐述了不同近交系小鼠的遗传差异及它们对小鼠应对病原体时的影响，比如：

 

  1. Toll样受体：TLR4是识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）外囊及克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi) 糖苷磷脂的主要受体。通常，Tlr4突变会使小鼠对革兰氏阴性菌的易感性增强。在实验室常用的近交系小鼠中，C3H/HeJ存在一个Tlr4的点突变，使其对革兰氏阴性菌的易感性增加。
  2. 补体成分5（C5）：补体系统的功能是提高病原体的清除和调节免疫复合物、细胞残骸及凋亡细胞的清除。A/J、 AKR/J、 DBA/2、DBA/1、 FVB/NJ和SWR品系的补体成分5中存在一个功能缺失的突变体（Hc0），使它们对炭疽杆菌 (Bacillus anthracis) 、烟曲霉菌 (Aspergillus fumigatus) 和白色念珠菌 (Candida albicans) 的易感性增加。
  3. 位于7号染色体从D7Mit341 到D7Mit247的区域：据报道，该区域与小鼠对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的易感性有关。129X1/Sv小鼠对肺炎球菌引起的肺炎的易感性显著高于C57BL/6小鼠品系。由于很多基因工程小鼠是用129品系的胚胎干细胞构建的，而这些小鼠与C57BL/6回交的代数经常不明确，导致遗传背景的组成存在差异，因此使用回交次数不同的基因工程小鼠对某些病原体的抗性研究可能会得出不同的结论。
  4. T细胞受体β，可变体8（Tcrb-V8）：Tcrb-V8在多种细胞中表达，包括自然杀伤性T（NKT）细胞和CD8 + NKT细胞。SJL/J、FVB/NJ、SWR、C57L和C57BR品系的Tcrb-V8基因在生殖细胞系中存在缺失，其中，SJL/J中的DNA缺失区域最大。
  5. 溶质载体家族11a成员1（Slc11a1）：C57BL/6J和BALB/c小鼠品系携带易感性（s）Slc11a1基因突变，该突变导致Slc11a1截短蛋白产生，使小鼠对分枝杆菌 (Mycobacteria spp) 和沙门氏菌 (Salmonella spp) 的易感性增加。 129X1/Sv和C3H/HeN品系携带抗性（r）等位基因，因此对上述病原体有抗性。不同的Slc11a1基因型也可能影响源自129胚胎干细胞但未完全回交至C57BL/6遗传背景的基因工程小鼠的免疫应答。
  6. 主要组织相容性复合物（MHC）分子：每个小鼠品系都有其自己的MHC单倍型，因此我们通常能够通过单个MHC单倍型识别不同的小鼠品系，如BALB/c和NZB/B1NJ小鼠中的H-2d或C3H/HeJ和B10.BR品系中的H-2k。H-2单倍型在移植研究以及对病原体的易感性和应答中很重要。例如，小鼠被呼吸道合胞病毒（RSV）感染后对慢性疾病的敏感性受MHC影响。 C3H/HeN（H-2k）对RSV有相对抗性，而BALB/c（H-2b）则相对敏感。品系的单倍型在对抗自身免疫性疾病的易感性中似乎也很重要。 与含有H-2b和H-2bm12单倍型的小鼠品系相比，具有H-2d和H-2k单倍型的小鼠品系与易患狼疮（如Faslpr，BXSB和Nzb.H-2bm12）的小鼠杂交后，其狼疮性肾炎的严重程度降低。

以上只简要列出了近交系小鼠间存在的一部分免疫多样性，建议大家阅读上文中提到的Sellers等人的综述了解更多相关的信息。

 

利用小鼠表型组数据库优化小鼠传染病建模

 

小鼠表型组数据库（Mouse Phenome Database，MPD）是由美国国立卫生研究院资助并由杰克森实验室维护的实验小鼠品系特征数据库网站，致力于促进人类健康和疾病的转化研究。MPD提供了一系列的小鼠表型数据集、详尽的实验数据采集方法以及在线数据分析工具。MPD的数据由来自全球各地的研究人员提供，包含了小鼠在未经处理或暴露于药物、环境因素及其他处理后的行为学、形态学和生理疾病相关的特征。MPD也提供了一些基因型数据，主要以单核苷酸多态性为主。

 

MPD中的“Pathogen and challenge studies”部分下设一个病原体研究集合（Pathogen）,目前收入了表一中列出的几类病原体研究数据集。

 

表一 MPD中的病原体研究相关数据集

致病媒介 研究项目
Bacillus anthracis lethal toxin 炭疽杆菌致死性毒素 anthrax 炭疽
Candida albicans 白色念珠菌 fungal infection 真菌感染
F.nucleatum (Fusobacterium nucleatum) 具核梭杆菌 periodontal pathogenic bacteria 牙周致病菌
influenza A (H1N1) virus 甲型H1N1流感病毒 viral infection 病毒感染
influenza A (H3N2) virus 甲型H3N2流感病毒 viral infection 病毒感染
influenza A (H5N1) virus 甲型H5N1流感病毒 viral infection 病毒感染
Neisseria musculi 奈瑟氏菌 mucosal bacteria 黏膜菌群
P.gingivalis (Porphyromonas gingivalis) 牙龈卟啉单胞菌 periodontal pathogenic bacteria 牙周致病菌
Plasmodium berghei 伯氏疟原虫 malaria 疟疾
Plasmodium chabaudi 夏氏疟原虫 malaria 疟疾
Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌 bacterial infection 细菌感染
Streptococcus zooepidemicus 兽疫链球菌 respiratory challenge study 呼吸道感染研究
Theiler's murine encephalomyelitis virus 泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒 virus 病毒
West Nile virus 西尼罗河病毒 viral infection 病毒感染

您可以在研究开展前从MPD网站查询小鼠的基线表型数据，实验方法等信息，为您的实验设计，背景鼠的选择等提供参考。您也可以查阅以上病原体研究的数据集对您需要构建的人类传染病小鼠模型进行优化。

 

利用近交系小鼠进行人类传染病研究举例

 

结核病

 

结核病是由结核分歧杆菌造成的细菌性传染病，结核分歧杆菌可能侵入人体全身各种器官，但主要影响肺脏，因此也称肺结核。结核病在中国法定报告传染病中发病和死亡人数均排在第2位。结核病虽然可以治愈，但治愈周期比较长，一般结核病治疗周期为6-8个月，如若发展成耐药结核，则治疗周期会延长到18-24个月，有时可达3年。

 

对于小鼠的结核病建模策略，通常会采用吸入或静脉注射感染结核杆菌，对感染后小鼠的生存率、不同组织的细菌计数和肺组织病理学等数据进行采集和分析。不同近交系的小鼠对于结核杆菌的易感性存在差异，其中C57BL/6J（000664）和BALB/cJ (000651)为抗性品系，而DBA/2J（000671）、C3H/HeJ（000659）、CBA/J（000656）、129X1/SvlmJ（000691）和A/J（000646）为易感品系（Cardona et al., 2003, Marquis et al., 2008, Jagannath et al., 2000）。

 

流感

 

流感是一种由流感病毒引起的，主要影响鼻、喉和支气管，偶尔影响肺部的急性呼吸道传染病。目前能引起季节性流行的流感病毒主要为甲型流感病毒（如H1N1和H3N2）和乙型流感病毒（如山型系和维多利亚系）。虽然多数流感感染者能在1-2周内康复，但对幼儿、老年人和患有其他严重病症者，流感病毒感染可能导致严重的并发症、肺炎和死亡。据估计，流感每年在全球范围内造成约300万-500万严重病例，29万-65万人死亡。

 

小鼠的流感模型通常采用鼻内接种进行感染。模型建立后，对小鼠感染后的存活率、体重减轻、体温、病毒滴度以及肺部病理、运动能力等数据进行采集和分析。几个常用小鼠品系对鼻内接种感染流感的敏感度随病毒株不同而存在差异，如对于病毒株H3N2的易感性由弱到强依次为：C57BL/6J（000664）、BALB/cByJ (001026)、A/J（000646）、DBA/2J（000671）。对于人H1N1甲型流感病毒，易感性较强的为DBA/2J（000671）和A/J（000646），其次为CBA/J（000656）和BALB/cByJ (001026)，易感性较弱的为FVB/NJ (001800) 和C57BL/6J（000664）（Trammell et al., 2012, Srivastava et al., 2009）。

 

利用基因工程小鼠进行人类传染病研究

 

虽然常规的近交系小鼠在人类传染病模型建立中存在诸多优势，但基于小鼠和人类在遗传上的差异，我们通常需要在近交系小鼠中进行遗传操作，使从小鼠模型获得的研究数据更具临床转化意义。在小鼠中进行人源基因的表达是一种非常普遍的做法。

 

严重急性呼吸道综合症（SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的呼吸道疾病。初期症状类似于流感，可出现发热、肌肉疼痛、嗜睡、咳嗽、喉咙疼以及一些其他非特异性症状。研究表明，SARS-CoV通过与人血管紧张素转化酶2(ACE2)结合进入人体内（Li et al.,2003）。但是由于小鼠Ace2和人ACE2蛋白存在结构上的差异，冠状病毒在小鼠模型中感染效率低下。2007年，人ACE2转基因小鼠模型（hACE2）被成功构建，该模型可以模拟人类感染SARS-CoV的整个过程。hACE2小鼠模型是将携带有人ACE2编码基因的载体引入到野生型小鼠中，其表达由人细胞角蛋白18（K18）启动子驱动，在上皮细胞中表达。当在K18-hACE2转基因小鼠（034860）鼻内接种人源SARS-CoV毒株后，小鼠会迅速感染并导致死亡。该研究中，病毒感染开始于气道上皮，随后扩散到肺泡，最终蔓延至大脑。感染导致肺部巨噬细胞和淋巴细胞浸润，并引起肺部和脑部的促炎细胞因子和趋化因子上调。感染后3至5天，K18-hACE2小鼠开始体重减轻，并伴有呼吸困难及精神萎靡，7天内全部死亡。这些结果显示 hACE2在上皮细胞中的转基因表达可将中度SARS-CoV感染转化为致命性疾病(McCray et al., 2007)。

 

2019新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的呼吸道感染疾病，感染后的一般症状包括发热、乏力、干咳，并逐渐出现呼吸困难，严重时会出现急性呼吸窘迫综合症、浓毒性休克以及难以纠正的代谢性酸中毒，出凝血功能障碍，少数患者病情危重，甚至死亡。最近的研究表明，同SARS-CoV一样，SARS-CoV-2也是通过ACE2进入人体细胞(Zhou et al., 2020, Yan et al.,2020)。因此hACE2小鼠模型也为COVID-19的疾病模型研究及疗法和疫苗的开发提供了有用平台。

 

利用近交系小鼠和基因工程小鼠在进行传染病研究的可操作性强，成本较低，但也存在一定的局限性，如：

  • 某些病原体无法感染小鼠（如造成艾滋病的HIV）；
  • 小鼠中检测到的病理变化可能无法反应人类疾病状况；
  • 小鼠的免疫应答与人类免疫应答存在差异；
  • 近交系小鼠遗传背景单一，无法体现人类群体的遗传多样性。

 

为了解决这些问题，人源化免疫系统小鼠模型和遗传多样性小鼠群体被运用到人类的传染病研究中，我们以后会进行介绍。

 

参考文献

  1. Cardona, Pere-Joan et al. 2003. “Widespread Bronchogenic Dissemination Makes DBA/2 Mice More Susceptible than C57BL/6 Mice to Experimental Aerosol Infection with Mycobacterium Tuberculosis.” Infection and immunity 71(10): 5845–54.
  2. Jagannath, C et al. 2000. “Hypersusceptibility of A/J Mice to Tuberculosis Is in Part Due to a Deficiency of the Fifth Complement Component (C5).” Scandinavian journal of immunology 52(4): 369–79.
  3.  Li, Wenhui et al. 2003. “Angiotensin-Converting Enzyme 2 Is a Functional Receptor for the SARS Coronavirus.” Nature 426(6965): 450–54. https://doi.org/10.1038/nature02145.
  4. Marquis, Jean-François et al. 2008. “Fibrotic Response as a Distinguishing Feature of Resistance and Susceptibility to Pulmonary Infection with Mycobacterium Tuberculosis in Mice.” Infection and immunity 76(1): 78–88.
  5. McCray, Paul B Jr et al. 2007. “Lethal Infection of K18-HACE2 Mice Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus.” Journal of virology 81(2): 813–21.
  6. Mestas, Javier, and Christopher C W Hughes. 2004. “Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.” The Journal of Immunology 172(5): 2731 LP – 2738.
  7. Sellers, R S, C B Clifford, P M Treuting, and C Brayton. 2012. “Immunological Variation between Inbred Laboratory Mouse Strains: Points to Consider in Phenotyping Genetically Immunomodified Mice.” Veterinary pathology 49(1): 32–43.
  8. Srivastava, Barkha et al. 2009. “Host Genetic Background Strongly Influences the Response to Influenza a Virus Infections.” PloS one 4(3): e4857.
  9. Trammell, Rita A, Teresa A Liberati, and Linda A Toth. 2012. “Host Genetic Background and the Innate Inflammatory Response of Lung to Influenza Virus.” Microbes and infection 14(1): 50–58.
  10. Yan, Renhong et al. 2020. “Structural Basis for the Recognition of the 2019-NCoV by Human ACE2.” bioRxiv: 2020.02.19.956946.
  11. Zhou, Peng et al. 2020. “A Pneumonia Outbreak Associated with a New Coronavirus of Probable Bat Origin.” Nature 579(7798): 270–73.
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